Микробная деструкция ароматических ксенобиотиков
Азокрасители и аминоароматические соединения применяются практически во всех областях человеческой деятельности как прямые и побочные продукты нефтехимической, лакокрасочной, фармацевтической и пищевой промышленности. Они в значительных количествах содержатся в стоках и твердых отходах этих предприятий, накапливаются в окружающей среде и могут в виде микропримесей оказывать токсическое и/или канцерогенное влияние на живые клетки. Пищевые азокрасители требуют особо пристального внимания, так как они вступают в прямой контакт с организмом человека и животных.
Азокрасители, в силу электрон-акцепторных свойств азосвязей, устойчивы к реакциям окисления и плохо поддаются разложению в аэробных условиях.
Реакции восстановления для них наиболее характерны и легко осуществимы в отсутствии кислорода.
Обесцвечивание азокрасителей Acid Orange 6 (АО6), Acid Orange 7 (АО7), Methyl Orange (МО), Methyl Red (MR), Tartrazine (Tn) и Ponceau S (PS) микробными сообществами из очистных сооружений Курьяновской станции аэрации (КСА) и завода «Эфес Пилснер» (ЕР) в анаэробных условиях.
Сравнение времен полного обесцвечивания азокрасителей Tartrazine (Tn), Ponceau S (PS), Sunset Yellow (SY), Azophloxine (Az) и Methyl Red (MR) микробными сообществами из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) разных млекопитающих.
При сравнении денитрифицирующей, сульфатредуцирующей и метаногенной реакций именно в результате последней происходит наименьшее изменение свободной энергии, однако технологически она более удобна, так как не требует внесения дополнительных акцепторов электронов в среду.
Разложение азокрасителей можно условно разделить на две стадии: 1) разрыв азосвязи, сопровождающийся образованием бесцветных ароматических аминов и 2) деградация аминов.
В анаэробных условиях восстановление азокрасителей, вероятно, является неспецифическим процессом, так как показано, что одна и та же чистая культура или одно анаэробное микробное сообщество способны без лаг-периода обесцвечивать целый спектр азокрасителей различной химической структуры. Анаэробное восстановление азокрасителей является комплексным процессом, включающим в себя различные механизмы разрыва азосвязи: ферментативный и неферментативный, нуждающийся в окислительно-восстановительных медиаторах и чисто химический и может локализоваться как внутри, так и преимущественно вне клеток.
Гипотетический механизм обесцвечивания азокрасителей:
Мвосст., Мокисл. — окислительно-восстановительный(е) медиа-тор(ы), восстановленный(е) и окисленный(е), соответственно, РФ — рибофлавин, СР — сульфатредуктор.
Это зависит от многих факторов и физико-химических характеристик азосоединения. Образовавшиеся ароматические амины могут быть как менее, так и более токсичными, чем исходные азокрасители, а также с разными скоростями подвергаться дальнейшей деструкции или длительно персистировать в среде.
Микробный процесс разрушения ароматических аминов отличается наличием лаг-периода и определенной специфичностью. Так, для Citrobacter freundii в составе метаногенного сообщества нами показана уникальная реакция восстанавления аминобензойных и аминосалициловых кислот до соответствующих спиртов с одновременным дезаминированием при росте на среде с доступным источником углерода и энергии. Специфичность микроорганизмов-деструкторов по отношению к тому или иному изомеру аминоароматического соединения связана, очевидно, с субстратной специфичностью ферментов, катализирующих первые этапы трансформации или расщепления (амино)ароматического кольца.
Основной проблемой разрушения таких соединений является химическая стабильность бензольного кольца. В аэробных условиях высокоактивный молекулярный кислород включается в ароматическое кольцо путем введения в молекулу одной или двух гидроксильных групп с помощью моно- или диоксигеназ. При этом образуется один из центральных интермедиатов (пирокатехин, пирокатехат или гентизат), который далее окисляется с раскрытием кольца в результате орто— или мета-расщепления. Полученные линейные продукты претерпевают β-окисление до простых кислот и альдегидов, которые в дальнейшем используются для конструктивного и энергетического обмена. Однако в присутствии кислорода многие ароматические амины могут образовывать смолообразные полимерные субстанции, устойчивые к дальнейшему разрушению. Поэтому отмечена возрастающая роль анаэробных процессов разрушения для таких веществ. В анаэробных условиях расщепление ароматических аминов представляет собой сложный многостадийный процесс. Вещества с заместителями на бензольном кольце сначала с помощью реакций периферического метаболизма превращаются в центральные интермедиаты — бензоил-КоА, резорцин или флороглюцин. Наиболее распространенным среди микроорганизмов считается бензоил-КоА-путь анаэробной деградации ароматических соединений, который включает стадии насыщения ароматического кольца и его деароматизацию с образованием линейных продуктов.
В метаногенных сообществах, разрушающих аминоароматические кислоты, нами детектирован ряд ароматических и линейных интермедиатов бензоил-КоА-пути.
Гипотетическая схема метаногенной биодеградации аминоароматических кислот (на примере 2- аминобензойной, 2-АБК и 5-аминосалициловой, 5-АСК кислот) в активных метаногенных сообществах.
Однако, несмотря на значительное число исследований, многие вопросы биохимических превращений аминоароматических субстратов до сих пор не выяснены. Например, некоторые факультативные анаэробы (в частности, денитрификаторы) могут совмещать реакции аэробного и анаэробного бензоил-КоА-путей деструкции ароматических соединений. Наличие такого гибридного альтернативного пути у микроорганизмов-членов сообщества не только дает дополнительную возможность конверсии ароматических субстратов при попадании кислорода извне, но и способствует гибкой и быстрой адаптации микробного сообщества к изменяющимся концентрациям кислорода.
При деградации сложных, трудно разлагаемых субстратов в анаэробных условиях важную роль играют микроорганизмы («первичные деструкторы»), способные осуществлять первые этапы преобразования молекул ароматических аминов. Именно они образуют продукты, которые служат субстратами для бродильщиков и синтрофных микроорганизмов. Далее, генерируемые этими группами С1-соединения, ацетат и водород потребляются сульфатредукторами, гомоацетогенами или метаногенами, в результате чего биогенные элементы сложного ксенобиотика возвращаются в круговорот веществ в биосфере. Деградация сложных органических веществ до метана и СО2 – это природный процесс, широко распространенный в анаэробных местообитаниях, однако при потреблении метаногенным сообществом ксенобиотических веществ — азокрасителей и ароматических аминов, обобщенная схема трофических связей модифицируется на начальных этапах.
Несмотря на то, что изучение структурно-функциональной организации природных и антропогенных микробных сообществ в последние годы претерпевает бурное развитие, данных о составе консорциумов, разрушающих азокрасители и ароматические амины в метаногенных условиях, крайне мало. Функциональные возможности сообщества в целом в значительной мере зависят от метаболического потенциала микроорганизмов, из которых оно состоит. В связи с этим важную роль в исследовании сообществ играет изучение микробного состава, выделение чистых культур и наиболее полное изучение их свойств. Многие, в том числе и малочисленные, входящие в сообщество микроорганизмы могут быть накоплены и выращены на лабораторных средах с последующим выделением в виде чистых культур. Однако многие входящие в сообщество микроорганизмы способны давать стабильный рост только в ко-культурах с партнерами. Выделению чистых культур препятствует также то, что сообщество находится в агрегированном состоянии (в виде гранул или хлопьев).
Пока не выявлена полная схема (трофическая сеть) превращений исходного субстрата с указанием всех интермедиатов и ферментов; лишь небольшая часть микроорганизмов, ответственных за разные стадии процесса биодеградации, получена в чистых культурах. Роль некультивируемых групп неизвестна.
Из-за токсичности азокрасителей и ароматических аминов, кроме изучения возможности деградации их сообществом, возникает вопрос о воздействии ксенобиотика или продуктов его разрушения на состав и функционирование сообщества. Поэтому отдельной задачей является изучение влияния этих веществ на природные микробные сообщества, в том числе путем создания лабораторных моделей. При изменении условий (в том числе, при вбросе ксенобиотика) будет происходить сукцессия сообщества, т.е. изменение его структуры, сопровождающееся сменой доминирующих видов, колебаниями численности микроорганизмов разных групп и, возможно, изменением состава членов сообщества, влекущее за собой и изменения в функционировании, что может оказать влияние на экосистему в целом.
На кафедре микробиологии имеется большой опыт получения микробных сообществ, разрушающих ксенобиотики ароматической природы, в частности, азокрасители. В настоящее время решаются следующие задачи:
- филогенетический анализ сообществ, деградирующих азокрасители, методом высокопроизводительного секвенирования вариабельных фрагментов генов 16S рРНК
- одновременное выделение чистых культур и их полная характеристика
- определение функциональной роли членов сообщества, в том числе осуществляющих деароматизацию (раскрытие кольца)
- определение трофических связей, существующих в сообществе
- выявление особенностей процесса биодеструкции пищевых азокрасителей в сообществах ЖКТ животных с разными пищевыми субстратами (жвачных, хищников, смешанного питания)
- исследование экологической опасности азокрасителей, в том числе пищевых
Литература
- Yemashova N. A., Kotova I. B., Netrusov A. I., Kalyuzhnyi S. V. Special traits of decomposition of azo dyes by anaerobic microbial communities. // Applied Biochemistry and Microbiology. — 2009. — Vol. 45, № 2. — P. 176–181.
- Lin’kova Y. V., Dyakonova A. T., Gladchenko M. A., Kalyuzhnyi S. V., Kotova I.B., Stams A.J.M., Netrusov A. I. Methanogenic degradation of (amino)aromatic compounds by anaerobic microbial communities.// Applied Biochemistry and Microbiology. — 2011. — Vol. 47, № 5. — P. 507–514.
- Тактарова Ю. В., Котова И. Б., Нетрусов А. И. Анаэробное разложение пищевых азокрасителей микробными сообществами, выделенными из кишечника млекопитающих. // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. – 2017. – Т. 13. – №. 2. – С. 24-30.
Научная группа:
Котова Ирина Борисовна
профессор
Тактарова Юлия Валерьевна
старший преподаватель
Дьяконова Анна
ведущий инженер