Системы антиоксидантной защиты в клетках строго анаэробных микроорганизмов
Известно, что продукты неполного восстановления кислорода (пероксид водорода, супероксид-анион радикал, гидроксил-радикал) токсичны для клеток и приводят к повреждению макромолекул. Поэтому для детоксикации активных форм кислорода аэробные и факультативно анаэробные организмы содержат ферменты антиоксидантной защиты, ключевыми из которых являются каталаза, различные пероксидазы и супероксиддисмутаза (СОД). На ранних этапах изучения устойчивости клеток микроорганизмов к окислительным стрессам считалось, что гибель строгих анаэробов в присутствии кислорода связана именно с отсутствием в их клетках антиоксидантных ферментов. Однако впоследствии каталазная активность была найдена у различных анаэробных микроорганизмов, в частности, у представителей рода Bacteroides; а СОД была обнаружена в клетках некоторых клостридий, сульфатредуцирующих бактерий (представители рода Desulfovibrio) и метаногенных архей (Methanobacterium bryantii, представители семейства Methanomicrobiales).
Предполагается, что при периодическом наступлении неблагоприятных аэробных условий в среде обитания (например, в циано-бактериальных матах, прибрежных донных осадках, периодически осушаемых рисовых полях, биоплёнках, кишечнике беспозвоночных и т.д.) синтез ферментов антиоксидантной защиты индуцируется и тем защищает клетки анаэробов от летального воздействия активных форм кислорода. К настоящему времени уже доказано, что некоторые метаногенные археи, клостридии и сульфатредуцирующие бактерии, обладающие популяционными (образование скоплений клеток, формирование сообществ с аэробными микроорганизмами, отрицательный аэротаксис) и защитными ферментативными механизмами противодействия окислительным стрессам, способны сохранять жизнеспособность при относительно длительном кислородном воздействии и быстро возобновляют рост после восстановления анаэробных условий.
Некоторые метаногенные археи и, в особенности, сульфатредуцирующие бактерии обладают в дополнение к СОД, каталазе и классическим пероксидазам чрезвычайно эффективными альтернативными ферментами антиоксидантной защиты, которые не образуют кислород в ходе катализируемых ими реакций и представляют собой уникальные негемовые Fe-содержащие белки – десульфоферродоксин и нееларедоксин (осуществляют детоксикацию супероксид-анион радикала по супероксидредуктазному типу), а также рубреритрин и нигеритрин (обладают НАДН-зависимой пероксидазной активностью). Кроме того, клетки многих сульфатредукторов, обладая электрон-транспортной цепью, даже способны к поглощению и восстановлению кислорода в качестве механизма защиты от окислительных стрессов.
Необходимо отметить, что биохимические и генетические механизмы сложных и тонко регулируемых адаптивных ответов строго анаэробных микроорганизмов на окислительные стрессы, эволюцию ферментов антиоксидантной защиты, а также значение феномена аэротолерантности многих анаэробных микроорганизмов для различных природных экосистем начали активно исследовать только в последние несколько лет. Фундаментальную научную значимость этих вопросов, в том числе и для изучения повреждений клеток всех живых организмов активными формами кислорода, а также для разработки новых перспективных антиоксидантов, трудно переоценить. Биохимические и молекулярно-биологические исследования ферментов антиоксидантной защиты в клетках строгих анаэробов также тесно связаны с изучением экологии и филогенетического состава микробных сообществ, существующих на границе окисленных и восстановленных зон, в частности, в водах меромиктических водоёмов и морских донных осадков.
Полученные на кафедре микробиологии ключевые результаты
В сотрудничестве с лабораторией одного из самых известных микробиологов и биохимиков профессора Р. Тауэра из Института наземной микробиологии Макса Планка (ФРГ) были очищены до гомогенного состояния и подробно охарактеризованы уникальные по своим молекулярно-биохимическим свойствам Fe-содержащие супероксиддисмутазы, а также монофункциональные гемовые каталазы из метаногенных архей Methanosarcina barkeri и Methanobrevibacter arboriphilus – экстремальных анаэробов, способных, тем не менее, сохранять жизнеспособность в условиях кратковременного аэробиоза. Проведен полный филогенетический анализ клонированных и секвенированных генов sod и kat метаногенных архей, причем обнаружение гена sod у представителя рода Methanosarcina представляет собой весьма интересный факт, поскольку данный ген не был найден ни у одного из филогенетически наиболее близких к Methanosarcinaceae микроорганизмов.
Продемонстрирован значительный положительный эффект экзогенного гемина на каталазную активность у Methanobrevibacter arboriphilus и, соответственно, на существенное возрастание устойчивости данной метаногенной археи к различным окислительным стрессам. Доказано предположение, что M. arboriphilus, не содержащий цитохромов и утративший способность к синтезу гема, способен к синтезу апофермента гемовой каталазы.
В сотрудничестве с отделом экотоксикологии Швейцарского федерального института водных ресурсов и технологий (EAWAG) на клетках архей и клостридий впервые были проведены комплексные биохимические и молекулярные исследования регуляции основных ферментов антиоксидантной защиты в условиях различных окислительных стрессов. Для Methanosarcina barkeri и Clostridium acetobutylicum продемонстрировано значительное изменение экспрессии соответствующих генов sod и kat в зависимости от характера, дозы и продолжительности окислительных стрессов, а также от стадии роста культур.
В сотрудничестве с лабораторией биоэнергетики и белковой инженерии Национального центра научных исследований Франции (CNRS) изучена выживаемость штаммов дикого типа сульфатредуцирующей бактерии Desulfovibrio vulgaris (одной из наиболее аэротолерантных строгих анаэробов) и полученных делеционных мутантных штаммов по генам, кодирующим супероксиддисмутазу (СОД) и супероксидредуктазу (СОР), в условиях различных окислительных стрессов – таким образом, была показана важнейшая роль этих ферментов в защите клеток сульфатредукторов от активных форм кислорода. Впервые получены данные по регуляции на ферментативном, протеомном и транскрипционном уровнях компонентов PerR регулона, нигеритрина, тиол-пероксидазы, СОР и Fe-содержащей СОД в клетках D. vulgaris при кислородных, пероксидных и супероксидных стрессах. Также были проведены комплексные исследования механизмов антиоксидантной защиты, включая обнаруженную электрон-транспортную цепь восстановления кислорода, у гипертермофильной анаэробной тиосульфат- и сероредуцирующей бактерии Thermotoga maritima.
В сотрудничестве с Институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН и Институтом океанологии им. П.П. Ширшова РАН в аэробной зоне подповерхностных вод Чёрного моря и в окисленных горизонтах донных осадков Баренцева моря были обнаружены метаболически активные клетки сульфатредуцирующих бактерий, что полностью коррелировало с полученными гидрохимическими данными по обнаружению сероводорода в этих биотопах. В настоящее время ведётся активная работа по выделению и идентификации чистых культур новых видов морских сульфатредукторов и изучению их систем антиоксидантной защиты. В частности, впервые из подповерхностных кислородсодержащих вод Чёрного моря была выделена в чистую культуру сульфатредуцирующая бактерия, описанная нами как новый вид Desulfofrigus euxinos, которая обладала высокой степенью аэротолерантности и эффективными системами антиоксидантной защиты.
В сотрудничестве с центральной лабораторией биотехнологии Национальных институтов здоровья США (NIH) показана роль малых бактериальных РНК RyhB и FnrS в качестве регуляторов синтеза белков антиоксидантной защиты в условиях сильных кислородных стрессов.
Методы, используемые в научно-исследовательской работе
Для изучения молекулярно-биохимических свойств и механизмов регуляции систем антиоксидантной защиты в клетках строго анаэробных микроорганизмов используются следующие методы: микробиологические (модифицированная техника анаэробного культивирования по Хангейту; исследование влияния различных окислителей на кинетику роста микроорганизмов), биохимические (измерение концентрации активных форм кислорода в среде культивирования; спектрофотометрические измерения активностей супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидаз в экстрактах клеток; очистка белков с использованием колоночной хроматографии в системе FPLC; электрофорез белков в денатурирующем полиакриламидном геле), молекулярно-биологические (амплификация, клонирование и секвенирование генов; Нозерн-блот гибридизация хемилюминесцентно-меченых фрагментов исследуемых генов с РНК, выделенной из подвергнутых окислительным стрессам культур; количественная ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией).
Планы научно-исследовательской работы
Изучение выживаемости новых видов и штаммов строго анаэробных сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) – одних из древнейших микроорганизмов на Земле, выделенных из кислород-содержащих вод и донных осадков Чёрного и Баренцева морей, в условиях окислительных стрессов различного характера и продолжительности. Изучение регуляции систем антиоксидантной защиты в клетках выделенных нами в чистые культуры морских СРБ на биохимическом (трансляционном) и генетическом (транскрипционном) уровнях. Работа поддерживается грантом РФФИ.
Изучение систем антиоксидантной защиты, в том числе и электрон-транспортных цепей, ответственных за восстановление кислорода, в клетках молочнокислых бактерий рода Lactobacillus – микроаэрофильных микроорганизмов, применяющихся в пищевой промышленности и обладающих большим пробиотическим потенциалом.
Изучение регуляции синтеза ферментов антиоксидантной защиты в клетках аноксигенных фототрофных бактерий (зелёные, пурпурные серные, пурпурные несерные) из коллекции кафедры микробиологии МГУ. Углублённый биоинформационный анализ наличия генов, кодирующих ферменты антиоксидантной защиты, во всех анонсированных геномах фототрофных бактерий.
Проведение скрининга культур строго анаэробных термофильных микроорганизмов на предмет их относительной устойчивости к различным окислительным стрессам. Изучение систем антиоксидантной защиты у наиболее аэротолерантных видов (в частности, представителей рода Thermotoga), где ключевую роль могут играть термостабильные пероксиредоксины (Prx) и феррипероксины (Fpx), причём последние считаются частью предковой, наиболее эволюционно древней системы детоксикации пероксидов.
Руководитель темы:
Брюханов Андрей Леонидович
старший научный сотрудник, кандидат биологических наук, доцент
brjuchanov@mail.ru